Un equipo interdisciplinar de científicos del Instituto de Ciencia y Tecnología de Austria (ISTA) ha presentado LIONESS, una nueva forma de observar la estructura y la dinámica del cerebro, en alta resolución y sin dañar el tejido, según publican en la revista 'Nature Methods'.
El tejido cerebral es el dispositivo computacional más sofisticado, con su red de unos 86.000 millones de neuronas. Comprender tal complejidad es una tarea difícil, por lo que para avanzar se necesitan tecnologías que desentrañen las minúsculas y complejas interacciones que tienen lugar en el cerebro a escalas microscópicas. La imagen es, por tanto, una herramienta fundamental de la neurociencia.
La nueva tecnología de obtención de imágenes y reconstrucción virtual desarrollada por el grupo de Johann Danzl en la ISTA supone un gran avance en la obtención de imágenes de la actividad cerebral y recibe el nombre de LIONESS (Live Information Optimized Nanoscopy Enabling Saturated Segmentation), un proceso que permite obtener imágenes, reconstruir y analizar tejido cerebral vivo con una amplitud y una resolución espacial imposibles hasta ahora.
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"Con LIONESS es posible obtener por primera vez una reconstrucción completa y densa del tejido cerebral vivo. Al obtener imágenes del tejido varias veces, LIONESS nos permite observar y medir la biología celular dinámica del cerebro siguiendo su curso --explica Philipp Velicky, primer autor--. El resultado es una imagen reconstruida de la organización celular en tres dimensiones, en la que el tiempo constituye la cuarta dimensión, ya que las imágenes de la muestra pueden obtenerse a lo largo de minutos, horas o días".
La fuerza de LIONESS reside en una óptica refinada y en los dos niveles de aprendizaje profundo que conforman su núcleo: el primero mejora la calidad de la imagen y el segundo identifica las distintas estructuras celulares en el denso entorno neuronal.
El trabajo es fruto de la colaboración entre el grupo Danzl, el grupo Bickel, el grupo Jonas, el grupo Novarino y las Unidades de Servicios Científicos del ISTA, además de otros colaboradores internacionales.
"Nuestro enfoque consistió en reunir a un grupo dinámico de científicos con una experiencia combinada única que traspasara los límites disciplinarios y que trabajaran juntos para cerrar una brecha tecnológica en el análisis del tejido cerebral", afirma Johann Danzl, de ISTA.
Hasta ahora era posible obtener reconstrucciones del tejido cerebral mediante microscopía electrónica. Este método obtiene imágenes de la muestra basándose en sus interacciones con los electrones. A pesar de su capacidad para captar imágenes con una resolución de unos pocos nanómetros, la microscopía electrónica requiere que la muestra esté fija en un estado biológico, que debe seccionarse físicamente para obtener información tridimensional. Por tanto, no se puede obtener información dinámica.
Otra técnica conocida hasta ahora, la microscopía óptica, permite observar sistemas vivos y registrar volúmenes de tejido intactos cortándolos "ópticamente" en lugar de físicamente. Sin embargo, el poder de resolución de la microscopía óptica se ve gravemente limitado por las propiedades de las ondas de luz que utiliza para generar una imagen. En el mejor de los casos, su resolución es de unos cientos de nanómetros, demasiado gruesa para captar detalles celulares importantes del tejido cerebral.
Con la microscopía óptica de superresolución, los científicos pueden romper esta barrera. Un trabajo reciente en este campo, denominado SUSHI (Super-resolution Shadow Imaging), ha demostrado que la aplicación de moléculas de colorante a los espacios que rodean las células y la aplicación de la técnica de microscopía de superresolución STED (Stimulated Emission Depletion), ganadora del Premio Nobel, revelan "sombras" superresueltas de todas las estructuras celulares y, por tanto, las visualizan en el tejido.
Sin embargo, ha sido imposible obtener imágenes de volúmenes enteros de tejido cerebral con una mejora de la resolución que se ajuste a la compleja arquitectura tridimensional del tejido cerebral. Esto se debe a que el aumento de la resolución también conlleva una elevada carga de luz de imagen sobre la muestra, lo que puede dañar o "freír" el sutil tejido vivo.Aquí radica la proeza de LIONESS, que se ha desarrollado, según los autores, para unas condiciones de obtención de imágenes "rápidas y suaves", lo que permite mantener viva la muestra. La técnica proporciona al mismo tiempo una superresolución isotrópica --es decir, igual de buena en las tres dimensiones espaciales-- que permite visualizar los componentes celulares del tejido con un detalle resuelto a nanoescala 3D.
Aquí radica la proeza de LIONESS, que se ha desarrollado, según los autores, para condiciones de obtención de imágenes "rápidas y suaves", lo que permite mantener viva la muestra. La técnica ofrece al mismo tiempo una superresolución isotrópica -es decir, igual de buena en las tres dimensiones espaciales- que permite visualizar los componentes celulares del tejido con un detalle resuelto a nanoescala 3D.
LIONESS recopila de la muestra la mínima información necesaria durante la fase de obtención de imágenes. A continuación, el primer paso de aprendizaje profundo completa la información adicional sobre la estructura del tejido cerebral en un proceso denominado restauración de imágenes.
De esta forma innovadora, se consigue una resolución de unos 130 nanómetros, siendo al mismo tiempo lo suficientemente suave como para obtener imágenes de tejido cerebral vivo en tiempo real. Juntos, estos pasos permiten un segundo paso de aprendizaje profundo, esta vez para dar sentido a los datos de imagen extremadamente complejos e identificar las estructuras neuronales de forma automatizada.
"El enfoque interdisciplinario nos permitió superar las limitaciones entrelazadas del poder de resolución y la exposición a la luz del sistema vivo, dar sentido a los complejos datos en 3D y acoplar la arquitectura celular del tejido con las mediciones moleculares y funcionales", explica Danzl.
Para la reconstrucción virtual, Danzl y Velicky se asociaron con expertos en informática visual: el grupo de Bickel en la ISTA y el grupo dirigido por Hanspeter Pfister en la Universidad de Harvard (Estados Unidos), que aportaron su experiencia en segmentación automatizada -el proceso de reconocimiento automático de las estructuras celulares en el tejido- y visualización, con el apoyo adicional del científico Christoph Sommer, del personal de análisis de imágenes de la ISTA.
Para las sofisticadas estrategias de etiquetado se contó con la colaboración de neurocientíficos y químicos de Edimburgo (Reino Unido), Berlín y el ISTA. Gracias a ello, fue posible establecer un puente entre las mediciones funcionales, es decir, leer las estructuras celulares junto con la actividad de señalización biológica en el mismo circuito neuronal vivo.
Para ello se obtuvieron imágenes de los flujos de iones de calcio en las células y se midió la actividad eléctrica celular en colaboración con el grupo Jonas de ISTA. El grupo de Novarino aportó organoides cerebrales humanos, a menudo apodados minicerebros que imitan el desarrollo del cerebro humano. Los autores subrayan que todo ello se vio facilitado gracias al apoyo experto de las unidades de servicios científicos de primera categoría del ISTA.
La estructura y actividad cerebrales son muy dinámicas; sus estructuras evolucionan a medida que el cerebro realiza y aprende nuevas tareas. Este aspecto del cerebro suele denominarse "plasticidad". De ahí que observar los cambios en la arquitectura tisular del cerebro sea esencial para desentrañar los secretos que se esconden tras su plasticidad.
