Estrategias terapéuticas genéticas de interés en psiquiatría.

Estrategias terapéuticas genéticas de interés en psiquiatría.

Rafael Castro.

Universidad de La Laguna
Dept. Fisiología. Facultad de Medicina.
C. P: 38320 La Laguna
Santa Cruz de Tenerife

[11/2/2004]



Introducción

En los últimos veinte años, la capacidad para el análisis y manipulación precisa de los ácidos nucleicos se ha ido aplicando progresivamente a la medicina. Pueden distinguirse cuatro periodos importantes: a) la era de los genes como sondas (iniciada en los ochenta), en la que se aplicó la genética molecular al diagnóstico preciso de enfermedades monogénicas; b) la era de los genes como factorías (iniciada en los noventa), en la que la transferencia de genes en cultivos celulares ha permitido la producción industrial de biofármacos; c) la era de los genes como fármacos (introducida en la clínica en los noventa) donde la transferencia génica en tejidos y órganos humanos permitiría la cura o tratamiento de enfermedades que, de otra manera, serían intratables. La cuarta era los genes como patrones se inició con la genómica estructural y funcional. En esta fase, los genes no son analizados como entidades únicas sino como funciones colectivas y entrelazadas. La era de los genes como fármacos , mejor conocida como la era de la terapia génica, tiene una historia reciente, habiendo realizado su incursión en los ensayos clínicos en 1990.

La terapia génica (TG) se define como la modificación genética de células para producir un efecto terapéutico. La mayoría de los estudios iniciales de TG iban dirigidos a pacientes con trastornos genéticos, en los que se reponía un gen defectuoso con una copia normal de ese gen. Sin embargo, la tendencia en aumento consiste en producir un efecto terapéutico en enfermedades congénitas o adquiridas, en las que aún no se conoce plenamente las bases genéticas. Desde la perspectiva de los trastornos psiquiátricos la TG puede considerarse como un remedio directo de una anormalidad en la expresión génica, pero lo más probable es que funcione como una manipulación molecular que sea semejante a los tratamientos farmacológicos (que suelen producir cambios en la expresión génica de manera menos directa).

La complejidad de los trastornos psiquiátricos, y la falta de conocimiento sobre sus etiologías fundamentales, implica que la aplicación de la TG a la enfermedad mental está aún en una fase teórica. No obstante, existen actualmente diversas estrategias experimentales de transferencia génica que, convenientemente refinadas, podrían amilorar o incluso revertir en un futuro la patofisiología de enfermedades tales como esquizofrenia, trastorno bipolar y depresión.

Estrategias de terapia genica en el sistema nervioso central

Existen dos maneras de transferir los genes terapéuticos (transgenes) en los tejidos: a) la TG ex vivo, consiste en el trasplante de células que han sido previamente genéticamente modificadas in vitro, y b) la transferencia directa in vivo del material genético en el cerebro. La TG ex vivo suele incluir la modificación de células autólogas, tales como fibroblastos o células de la médula ósea u otro tipo de células, incluyendo células madre. Usualmente es designada para actuar como una bomba biológica que suministra diferentes sustancias difusibles, generalmente neurotransmisores o factores neurotróficos.

La TG in vivo puede también usarse como fuente de producción local de sustancias difusibles. En contraste a la aproximación ex vivo, el suministro de genes in vivo permite también la intervención directa en los procesos endógenos intracelulares. Entre las aplicaciones posibles estaría la expresión de moléculas que sustituyen a proteínas defectivas. Esta estrategia podría ser útil para trastornos recesivos en los que la pérdida de la función es el resultado de mutaciones genéticas. La TG in vivo puede emplearse también para bloquear directamente la función o producción de proteínas patológicas, mediante la expresión de proteínas negativas dominantes (1), ARNs antisentido (2, 3) o pequeños ARN interferentes (4).

Esta estrategia puede ser apropiada para trastornos dominantes autosómicos en los que hay una ganancia tóxica de la función. Si el futuro de la TG está en competir con éxito con el tratamiento farmacológico clásico, es necesario disponer de métodos económicos, simples y eficaces de transferencia génica. Una de las razones de pérdida de popularidad en los ensayos clínicos de TG ex vivo, cuando se compara con los protocolos in vivo, es el alto coste que lleva asociado (5). Además, para lograr una transferencia génica exitosa es crucial la elección del vehículo (vector) que va a suministrar el gen terapéutico al sistema nervioso. Básicamente, los vectores utilizados en TG pueden dividirse en dos grandes grupos, virales y no virales, cada uno de los cuales presenta ventajas e inconvenientes.

Los vectores no virales (liposomas, complejos de ADN-proteína, ADN plasmídico) tienen algunas ventajas: son fáciles de producir y almacenar, no presentan restricciones en relación con el tamaño del gen o molécula terapéutica, y no provocan una respuesta inmunológica significativa. Sin embargo, han tenido de momento una menor aplicación en TG debido a que disponen de una baja capacidad de transducción, además de la dificultad para conseguir una expresión duradera del transgén (requisito que sería fundamental en TG de enfermedades neurodegenerativas).

Los vectores virales ofrecen una serie de ventajas: a) su alta capacidad de transducción (los virus pueden entrar fácilmente en una gran número de neuronas y depositar su material genético en el núcleo, por tanto, son vectores mucho más eficaces que los sistemas no virales); b) la posibilidad de aprovechar las propias secuencias reguladoras del virus para controlar la expresión del transgén, y c) la posibilidad de conseguir la integración del transgén en el genoma de la neurona receptora (aunque esto depende del virus que se utilice como vector) y, por tanto, conseguir una expresión indefinida (al menos en teoría) del gen. No existe aún ningún virus que se haya erigido como vector de elección para la transferencia génica neuronal. Los virus usados en TG difieren en la cantidad de ADN que puede empaquetarse en ellos, en los títulos (una medida de la concentración del virus) que pueden obtenerse, en la velocidad con la que el vector empieza a expresar el transgén después de la infección, en la magnitud y duración de la infección, en el porcentaje de neuronas infectadas dentro de un radio particular del sitio de inyección, y en la probabilidad de que el vector cause inflamación en el cerebro.

Además de su naturaleza posmitótica, el cerebro presenta importantes desafíos, debido a su relativa inaccesibilidad. Aunque ha habido algunos éxitos en la inyección de vectores por vías intraocular, intraorbital o intravenosa (esta última con liposomas), la mayoría de los estudios han recurrido a la inyección estereotáxica del vector directamente en el parénquima cerebral o intraventricularmente. En el primer caso, los vectores infectan preferentemente neuronas, y el nuevo producto proteico genera sus efectos intraneuronalmente. En contraste, en el caso de la infusión intraventricular, el vector suele transducir las células ependimarias que tapizan los ventrículos. En esta situación, los productos proteicos utilizados suelen ser aquellos que son secretados (por ejemplo, sobreexpresión de genes de neurotrofinas).

Los vectores virales presentan también algunos inconvenientes, como son: a) dificultad para obtener altos títulos de virus recombinantes (con el transgén incorporado en su genoma); b) la limitación que la capacidad de empaquetamiento del virus impone al tamaño del transgén; c) problemas relacionados con la bioseguridad. Los virus tipo salvaje necesitan ser manipulados para que no sean perjudiciales para el paciente, y deben llevar y expresar las secuencias extrañas de ADN. Las principales modificaciones son: la eliminación de la capacidad de replicación viral (y las consecuentes propiedades citotóxicas/citolíticas) y la introducción del transgén/es en el genoma viral, sin afectar a otras estructuras y propiedades virales (por ejemplo, empaquetamiento, vía de entrada celular e integración). Actualmente, los virus más utilizados como vectores en TG son los retrovirus, adenovirus (Ad), virus del herpes simples tipo 1 (HSV-1), virus adenoasociados (AAV) y lentivirus (LV). Los vectores retrovirales (oncoretrovirus) representan un importante obstáculo para la transferencia génica en cerebro, debido a su incapacidad para transducir las neuronas (6).

El vector ideal es aquel que puede obtenerse fácilmente en el laboratorio en forma pura y con altos títulos, se transduce de forma estable, eficaz y duradera en las neuronas, y no produce efectos citotóxicos, inflamación o respuestas inmunes. Dicho vector debería incorporarse de forma selectiva en las neuronas objeto de tratamiento, permitiendo además una regulación exógena del transgén por parte del terapeuta. Aunque, desafortunadamente, dicho vector no ha sido aún desarrollado, están produciéndose constantemente nuevos avances en el desarrollo de vectores para TG.

Un primer avance sería el poder construir vectores con múltiples genes o administrar múltiples vectores que expresen diferentes genes. Un segundo punto sería poder reducir la heterogeneidad celular existente en diferentes regiones del cerebro. Al hilo de esto, las neuronas de las diferentes regiones cerebrales tienen muchos determinantes antigénicos en sus membranas celulares. Relacionado con ello, los virus que se utilizan como vectores infectan preferentemente un tipo de neuronas sobre otras. Entonces, es posible modificar las proteínas de la cubierta de los virus, lo suficiente para cambiar sus preferencias.

Además, puede modificarse el promotor empleado en la construcción del vector y, así, restringir la expresión génica a un tipo celular. Por ejemplo, aunque muchos vectores virales infectan neuronas, puede ocurrir algún grado de infección en la glía (con expresión del transgén incluída). Para solventar esto, puede utilizarse un promotor específico de neuronas en la construcción del vector viral. Un avance adicional está relacionado con la expresión del transgén. La TG neuronal típicamente emplea vectores virales constitutivos, es decir, que contienen un promotor viral que activa la expresión del transgén tan pronto ocurre la infección. Una alternativa importante son los promotores inducibles (la expresión del transgén no ocurre de forma automática tras la inyección sino que, por el contrario, el nuevo gen permanece transcripcionalmente en estado latente hasta que sea inducido). Entre las señales inductoras, pueden usarse algunos factores exógenos artificiales (como tetraciclina, en un sistema que utilice un promotor regulado por tetraciclina, o un metal pesado, en un sistema que emplee un promotor de metalotioneina). También pueden elegirse señales inductoras endógenas de una célula u organismo. Por ejemplo, se ha descrito un vector que contiene un elemento de respuesta a hipoxia en su promotor. Este vector se ha empleado en modelos experimentales de hipoxia-isquemia, en los que se induce la expresión de un gen neuroprotector ante un ambiente pobre en oxígeno (7).

Hasta ahora la estrategia estándar de TG se ha basado en lograr un incremento en la expresión del transgén. Una expresión prolongada del transgén implica que éste se ha integrado en el genoma de la célula hospedera. Sin embargo, la mayoría de los vectores virales provocan la integración al azar en el genoma (aunque los vectores adenovirales no se integran), aumentando con ello la posibilidad de que ocurran alteraciones génicas (incluyendo a genes del ciclo celular o supresores de tumores). Recientemente se ha descrito que la inserción de ADN extraño en el genoma puede inducir marcadas alteraciones en la metilación (8). Estos cambios epigenéticos pueden tener profundas implicaciones, tales como la relación entre desarrollo de tumores y niveles mayores de metilación. Las restricciones al tamaño del transgén que imponen los vectores virales puede reducir la habilidad para incorporar importantes elementos reguladores, especialmente aquellos necesarios para asegurar un nivel adecuado de expresión. Finalmente, los componentes virales inherentes al transgén pueden elicitar una respuesta por parte del sistema inmunológico del hospedero, llevando a una caída en la expresión del mismo.

Las limitaciones asociadas con la TG tradicional, basada en el aumento de expresión génica, han conducido también a la búsqueda y perfeccionamiento de estrategias no virales alternativas. Específicamente, hay un creciente interés en la reparación génica, en la cual, se diseñan ácidos nucleicos que corrigen mutaciones genómicas precisas (9). Las estrategias actuales de reparación génica incluyen: la quimeroplastia (son oligonucleótidos quiméricos ARN/ADN), oligonucleótidos de una cadena y de tres cadenas (triplex), y la reposición homóloga de pequeños fragmentos (10). La reparación génica sitio-específica presenta una serie de ventajas respecto a la tradicional: a) la reparación in situ de la mutación posibilita que el gen permanezca bajo el control de sus elementos reguladores naturales; b) tiene el potencial de actuar tanto sobre mutaciones recesivas como dominantes, a diferencia de la basada en el incremento de expresión génica que queda restringida a enfermedades recesivas; c) las moléculas empleadas en el proceso de reparación son, en general, menos inmunogénicas; d) el menor tamaño de las moléculas reparadoras puede aumentar la eficacia de la transferencia celular y de la translocación nuclear, respecto a los sistemas plasmídicos; e) posibilita una reparación génica efectiva y permanente, sin necesidad de aplicar muchos tratamientos.

Aunque existen muchas ventajas en las técnicas de corrección génica, pueden encontrarse aún limitaciones significativas para las diferentes estrategias. Por ejemplo, es necesario conocer la secuencia exacta de cada mutación objeto de reparación, así como del genoma circundante. Además, puede haber variaciones marcadas en la frecuencia de reparación entre las diferentes estrategias.

Una barrera importante de la terapia de sustitución no viral ha sido la falta de integración genómica del transgén que, obviamente, excluye la posibilidad de expresión a largo plazo. El sistema transposón no viral sleeping-beauty constituye un avance clave para dicha barrera (11). Este sistema utiliza una enzima transposasa reconstruida que puede liberar un transposón (con el transgén incluido) mediante su unión a secuencias específicas de ADN. La combinación de transposasa y transposón constituye un vehículo prometedor para la integración estable y duradera de los transgenes.

Terapia genica y trastornos psiquiatricos

El objetivo básico de la TG en el cerebro es introducir una pieza de material genético (con la secuencia génica deseada) en las células cerebrales, para lograr un cambio terapéutico en la función cerebral. La TG ha sido empleada en modelos animales de síntomas psiquiátricos con dos propósitos: 1) para averiguar si ciertas manipulaciones génicas pueden causar síntomas y 2) si es factible emplear la transferencia génica para prevenir o reducir dichos síntomas, lo que podría conducir a nuevos tratamientos en el ser humano.

Hasta ahora se han empleado dos estrategias fundamentales para modificar la expresión génica en el cerebro: introducir un transgén en las propias células cerebrales o trasplantar células genéticamente modificadas en el mismo. Esta segunda estrategia resulta más apropiada si uno espera reponer o aumentar una molécula de señalización extracelular, tal como un neurotransmisor o un factor neurotrófico. Por ejemplo, se ha descrito que el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) disminuye con el estrés en roedores (12). Además, el tratamiento con antidepresivos induce un incremento de dicho factor en humanos y animales (12, 13). Sin embargo, aunque el BDNF no puede administrarse en el cerebro con las técnicas de inyección actualmente disponibles, podría inducirse un aumento de sus niveles en regiones específicas del cerebro mediante el trasplante de células genéticamente modificadas para expresar dicho factor. Esto podría ser una opción viable para la depresión tratamiento-resistente (14).

La transferencia génica mediada por vectores virales es de momento la estrategia más usada (en cerebros de animales de experimentación) y con capacidad de producir cambios en el comportamiento. Un ejemplo ilustrativo lo encontramos en diferentes estrategias de TG que afectan la neurotransmisión serotoninérgica. Se ha utilizado un sistema vector amplicón, basado en el virus herpes simplex, para sobreexpresar los autoreceptores 5-HT1B de serotonina en el núcleo dorsal del rafe (uno de los centros importantes donde se concentran cuerpos celulares serotoninérgicos con amplia proyección al sistema límbico). Este vector infecta sobre todo neuronas, induciendo una expresión génica eficiente aunque no muy duradera (15). La inyección estereotáxica de dicho vector en el rafe dorsal induce una respuesta alterada al estrés y conductas relacionadas con ansiedad (16). En contraste, la inyección del mismo vector en el núcleo accumbens (un centro relacionado con el placer, refuerzo y anticipación) sensibilizaba a los animales a conductas inducidas por la cocaína (17). Esto demostraba que la misma manipulación de transferencia génica, realizada en diferentes neurocircuitos, puede tener diferentes consecuencias conductuales.

Actualmente se sabe que la exposición crónica a cocaína induce la formación de AMPc, el cual activa la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) (18). Esto llevaría entonces a la fosforilación, y activación resultante, del factor de transcripción CREB y, en consecuencia, a la expresión del gen de dinorfina (18). La unión de dinorfina a su receptor k (receptor opiáceo) satura las propiedades reforzantes de la cocaína (19). En este contexto, la activación de dicha vía provoca la necesidad de dosis mayores de cocaína, para inducir las mismas propiedades reforzantes. Una confirmación sólida a la existencia de esta vía se encuentra en los estudios de transferencia génica de Nestler et al, (1998) (20), pioneros en la neurobiología de la adicción. El estudio consistía en exponer ratas de laboratorio a cocaína, en un protocolo de condicionamiento de lugar, en el que las propiedades reforzantes de la droga quedan manifiestas por el grado en que el animal regresa posteriormente al mismo sitio en que fue expuesto a cocaína. En este paradigma, la sobreexpresión de CREB (mediada por un virus herpes simplex, HSV-1) en núcleo accumbens, redujo las propiedades reforzantes de la cocaína. Sin embargo, la administración de un mutante de CREB indujo un incremento del refuerzo. Los autores confirmaron en dicho estudio que los efectos inhibidores del refuerzo (obtenidos tras la manipulación de CREB) utilizaban la vía dinorfina/receptor k.

Cabe destacar también el interesante trabajo del equipo del Dr. Sapolsky, en Stanford, basado en una estrategia anti-glucocorticoide de terapia génica, también empleando vectores virales (ver excelente revisión en Am. J. Psychiatry 160: 208-220, 2003).

La transfección no viral de genes en células en cultivo ha sido también una estrategia común de investigación durante años, y puede realizarse con métodos simples. Algunos de estos métodos se han aplicado también en el cerebro (21). Por ejemplo, puede realizarse transferencia de ADN en las células cerebrales usando vectores lipídicos comercialmente disponibles (lipofección) o mediante polímeros, como la polietilenimina. Con este polímero se ha logrado incrementar o disminuir la expresión del transportador de serotonina en las células del rafe dorsal, utilizando secuencias antisentido del transportador de serotonina (22) [El nivel de expresión de genes endógenos puede reducirse empleando oligonucleótidos antisentido (AONs) (técnica referida como knockdown génico). La base de esta técnica consiste en que el ADN hibrida con una secuencia específica en el ARNm, induciendo el heteroduplex formado la degradación enzimática del ARNm diana (con la consecuente reducción de casi un 50% en las proteínas asociadas)].

Los resultados obtenidos en dicho estudio mostraban cambios en la densidad del transportador, así como en actividades conductuales circadianas y neuroquímicas (22). Los AONs han sido también utilizados para reducir la expresión de diferentes receptores de serotonina en el cerebro, como por ejemplo el 5-HT6, habiendo cambios en diversas conductas (23, 24). Cuando se compara con los AONs, las tecnologías anteriormente comentadas, tales como el ARN interferente, pueden ofrecer incluso una degradación más eficiente del ARNm diana (pero aún hay muy pocos estudios in vivo).

La esperanza en conseguir tratamientos genéticos efectivos para los trastornos psiquiátricos puede parecer no realista en algunos casos. Sin embargo, la manipulación génica llevada a cabo en modelos animales puede convertirse en una herramienta poderosa que clarifique la causa de estos trastornos. En este sentido, hemos visto que se dispone de un abanico cada vez más amplio de estrategias de terapia génica viral, no viral, y combinadas. Finalmente, los esfuerzos de colaboración entre clínicos e investigadores básicos proporcionarán probablemente un mayor acercamiento hacia una terapia génica efectiva para los trastornos psiquiátricos.

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